Scheren und Kleber der Gentechnik

Mit Plasmiden lassen Gene in andere Organismen einzuschleusen. Dazu ist es aber notwendig, das betreffende Gen in das Plasmid einzubauen. Die Schwierigkeit besteht vor allem darin, dass die Plasmide im Vergleich zum Bakterienchromosom sehr klein sind. Das Bakterienchromosom mit einer Länge von ca. einem Millimeter, das fest verknäuelt einen Tausendstel mm Durchmesser hat, ist im Verhältnis groß zu den 100mal kleineren Plasmiden. Ein Gen, das in ein Plasmid eingefügt werden soll, ist etwa ein Zehntausendstel Millimeter groß, dabei hat die DNA-Helix eine Dicke von zweimillionstel Millimeter. Mit mechanischen Werkzeugen kommt man hier nicht weiter. Da benötigt man schon molekularbiologische Feinmechanik, um den Plasmidring an spezifischen Orten aufzutrennen, um dann das betreffende Gen vollständig in die DNA-Struktur einzubauen. Gelöst wurde dieses Problem, indem man wieder mal auf Enzyme zurückgreift.

 

Worum gehts?

 

Restriktionsenzyme sind das Werkzeug der Molekularbiologen, mit dem sie punktgenau DNA zerschneiden können. Wie diese Scheren arbeiten, wird hier besprochen.

Nach dem Schneiden muss häufig wieder alles zusammengefügt werden, jetzt kommen die Ligasen zum Einsatz, die anschließend kurz vorgestellt werden.

 

Retriktionsenzyme die Scheren

  • Restriktionsendonucleasen (Restriktasen)
  • Bakterien schützen sich damit gegen Bakteriophagen
  • Restriktasen zerscheiden Viren-DNA

EcoRI

  • benannt nach dem E. coli Stamm RY 13
  • hat die Schnittstelle: "GAATTC" und zwar zwischen G und A
  • am komplementären Strang (CTTAAG) spaltet Eco RI auch zwischen A und G
  • viele Restriktasen zerschneiden die DNA an bestimmten Basenpaaren
Schnittstelle EcoRI

Vom 5´-Ende gelesen besitzen die Erkennungssequenzen die gleiche Basensequenz.

 

Erkennungssequenzen sind Palindrome

  • Bei den Erkennungssequenzen handelt es sich in der Regel um Palindrome wie "OTTO, stets, Regallager oder Reliefpfeiler".
  • Das sind Zeichenketten, die von vorn und von hinten den gleichen Begriff ergeben.

Die klebrigen Enden - "sticky ends"

  • Die zerschnittene DNA zerfällt bei niedriger Temperatur nicht in zwei Teile, weil die überstehenden Enden lose aneinander kleben, sogenannte klebrige Enden („sticky ends“). A und T sowie C und G der „sticky ends“ ziehen sich noch elektrostatisch an.
  • Verschiedene Enzym-Scheren erzeugen gleiche Enden.
  • Mit ATP verbrauchenden Ligasen lässt sich die Verbindung wieder herstellen.

Machen Sie die „sticky ends“ sichtbar, indem Sie durch drug & drop den DNA-Abschnitt auseinander ziehen.

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Hpa 1 mit dem glatten Schnitt

Einige Restriktionsenzyme erzeugen glatte Schnitte (glatte Enden, blunt ends).

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Einige Enzym - Scheren erzeugen komplementäre Enden

  • Die Restriktionsenzyme BamHI (Erkennungssequenz GGATCC) und Bg/II (Erkennungssequenz AGATCT) lassen beide klebrige Enden mit der gleichen Sequenz GATC entstehen.
  • Die dadurch entstandenen Enden können sich verbinden und lassen sich dann mittels Ligasen „verkleben“.
  • Ein Schneiden ist dann nicht mehr möglich.
  • Machen Sie die Schnittstellen sichtbar und verbinden Sie die verschiedenen Stücke (drug & drop)
  • Nach dem Zusammenfügen der "klebrigen Enden" geht das Palindrom verloren.

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Die Ligase - der Kleber

  • Die entstandenen Genfragmente, die mit zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen geschnitten wurden und über komplementäre "klebrige Enden verfügen, können mittels Ligasen verbunden werden.
  • Ein Schneiden ist anschließend nicht mehr möglich, da durch das „Verkleben“ eine Sequenz entsteht, die kein Palindrom darstellt.

Zusammenfassung

  • Restriktasen und Ligasen ermöglichen das gezielte Schneiden und Verbinden von DNA-Molekülen.
  • Sie sind Scheren und Kleber der Molekulargenetik.
  • Heute sind über 3500 Restriktionsenzyme bekannt, nur einige sind geeignet für die Gentechnik.
 

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